6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

Environ Health Perspect. 2009 Mar; 117(3): 348–353.
Published online 2008 Nov 14. doi:  10.1289/ehp.0800096

PMCID: PMC2661902
PMID: 19337507

Research

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk
Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon
Cathy A. Laetz,1 David H. Baldwin,1 Tracy K. Collier,1 Vincent Hebert,2 John D. Stark,3 and Nathaniel L. Scholz1
1
 NOAA (National Oceanic and Atmospheric Administration) Fisheries, Northwest Fisheries Science Center, Seattle, Washington, USA
2
 Food and Environmental Quality Laboratory, Washington State University, Richland, Washington, USA
3
 Department of Entomology, Ecotoxicology Program, Washington State University, Puyallup, Washington, USA
Address correspondence to N.L. Scholz, NOAA Fisheries, Northwest Fisheries Science Center, 2725 Montlake Blvd. E., Seattle, WA
98112 USA. Telephone: (206) 860­3454. Fax: (206) 860­3335. E­mail: nathaniel.scholz@noaa.gov
The authors declare they have no competing financial interests.
Received 2008 Aug 14; Accepted 2008 Nov 13.
Copyright notice
Publication of EHP lies in the public domain and is therefore without copyright. All text from EHP may be reprinted freely. Use of
materials published in EHP should be acknowledged (for example, ?Reproduced with permission from Environmental Health
Perspectives?); pertinent reference information should be provided for the article from which the material was reproduced. Articles from
EHP, especially the News section, may contain photographs or illustrations copyrighted by other commercial organizations or individuals
that may not be used without obtaining prior approval from the holder of the copyright.

This article has been cited by other articles in PMC.

Abstract

Go to:

Background

Go to:

Mixtures of organophosphate and carbamate pesticides are commonly detected in freshwater habitats
that support threatened and endangered species of Pacific salmon (Oncorhynchus sp.). These pesticides
inhibit the activity of acetylcholinesterase (AChE) and thus have potential to interfere with behaviors
that may be essential for salmon survival. Although the effects of individual anticholin­esterase
insecticides on aquatic species have been studied for decades, the neurotoxicity of mixtures is still
poorly understood.

Objectives

Go to:

We assessed whether chemicals in a mixture act in isolation (resulting in additive AChE inhibition) or
whether components interact to produce either antagonistic or synergistic toxicity.

Methods

Go to:

We measured brain AChE inhibition in juvenile coho salmon (Oncorhynchus kisutch) exposed to
sublethal concentrations of the organophosphates diazinon, malathion, and chlorpyrifos, as well as the
carbamates carbaryl and carbofuran. Concentrations of individual chemicals were normalized to their
respective median effective concentrations (EC50) and collectively fit to a nonlinear regression. We
used this curve to determine whether toxicologic responses to binary mixtures were additive,
antagonistic, or synergistic.

Results
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

Go to:
1/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

We observed addition and synergism, with a greater degree of synergism at higher exposure
concentrations. Several combinations of organophosphates were lethal at concentrations that were
sublethal in single­chemical trials.

Conclusion

Go to:

Single­chemical risk assessments are likely to underestimate the impacts of these insecticides on
salmon in river systems where mixtures occur. Moreover, mixtures of pesticides that have been
commonly reported in salmon habitats may pose a more important challenge for species recovery than
previously anticipated.
Keywords: acetylcholinesterase, carbamates, conservation, organophosphates, pesticides, risk
assessment, salmon, synergy, toxicity
Pesticides are chemical substances that are used to kill, repel, or regulate the growth of biological
organisms. This diverse group includes insecticides, herbicides, fungicides, nematicides, acaricides,
rodenticides, avicides, wood preservatives, and antifoulants. The U.S. Environmental Protection
Agency (EPA) recently estimated that > 1.2 billion pounds of pesticides are applied to crops, forests,
residential areas, public lands, and aquatic areas in the United States each year (Kiely et al. 2004). The
release of these chemicals into the environment creates a potential for unintended adverse health
impacts to both humans and nontarget wildlife.
Mixtures of pesticides are common in the human food supply [National Research Council (NRC)
1993]. Pesticide mixtures are also common in the aquatic environment, including lakes, river, streams,
and other surface waters that support aquatic life (Gilliom 2007). Assessing the cumulative toxicity of
pesticides in mixtures has therefore been an enduring challenge for environmental health research
(Monosson 2005) as well as ecotoxicology (Eggen et al. 2004) for the past several decades. In 1996 the
U.S. Congress passed the Food Quality Protection Act (FQPA 1996), which directs the U.S. EPA to
assess the human health risks from cumulative exposures to pesticides that share a common mechanism
of action. Consideration of mixture toxicity is also required when pesticide tolerances are reassessed
under the Federal Food, Drug, and Cosmetic Act (1938). At present, for aquatic species there are no
equivalent mandates for consideration of mixture toxicity under the Federal Insecticide Fungicide and
Rodenticide Act (1972) or in the development of aquatic life criteria under the Clean Water Act of
1972 (Clean Water Act 1972; Lydy et al. 2004).
The cumulative toxicologic impacts of pesticide mixtures is of particular concern for salmon and
steelhead populations that are currently listed as either threatened or endangered under the U.S.
Endangered Species Act (ESA 1973). Many wild salmon stocks are in decline across much of the
western United States [Nehlsen et al. 1991; NOAA (National Oceanic and Atmospheric
Administration) Fisheries 2008]. Past salmon population extinctions (Nehlsen et al. 1991) and current
declines have been caused by decades of habitat degradation, overharvest, hydro­power operation, and
hatchery practices (NRC 1996). Major river systems that drain large agricultural and urban areas in
California, Oregon, Washington, and Idaho provide freshwater habitat for ESA­listed salmon and
steelhead (Figure 1). Extensive surface water monitoring for pesticides, as part of the U.S. Geological
Survey (USGS) National Water Quality Assessment program (NAWQA), has shown that current­use
pesticides are frequently detected in these salmon­supporting river systems (Table 1) (see also more
recent monitoring studies by Carpenter et al. 2008; USGS 2008; Washington State Department of
Ecology 2008). Furthermore, pesticides almost always occur in mixtures with other pesticides.
Analysis of NAWQA monitoring data found that > 90% of water samples from urban, agricultural, and
mixed­use streams contained two or more pesticides (Gilliom 2007). The toxicologic effects of these
mixtures on the health of salmon are largely unknown.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

2/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

Open in a separate window
Figure 1
The geographic distribution of threatened and endangered salmon in the western United States overlaps
with study units from the USGS NAWQA program. Dashed lines mark the boundaries of NAWQA study
areas where pesticide concentrations have been measured in surface waters. Gray shaded areas show the
freshwater range of ESA­listed salmon populations.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

3/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

Table 1
Frequency of insecticide detections (% of samples) by the USGS in surface waters of NAWQA
basins in the western United States.
NAWQA basin
NAWQA basin
Puget Sound (Ebbert et al. 2000)

Diazinon
Diazinon Malathion
Malathion Chlorpyrifos
Chlorpyrifos Carbaryl
Carbaryl Carbofuran
Carbofuran
48

D

3

D

D

4

2

9

6

5

Yakima River (Fuhrer et al. 2004)

18

D

D

90

ND

Willamette (Wentz et al. 1998)

35

5

21

18

29

Sacramento River (Domagalski et al. 2000)

75

33

38

60

36

San Joaquin (Dubrovsky et al. 1998)

71

8

52

25

5

Columbia Plateau (Williamson et al. 1998)

Abbreviations: D, detected but frequency not reported; ND, not detected.

In the years since the enactment of the FQPA, the U.S. EPA has identified several classes of pesticides
that share a common mode of action (U.S. EPA 2002). Among these are the organophosphate (OP) and
N­methyl carbamate (CB) insecticides. These two classes of chemicals inhibit the enzyme
acetylcholinesterase (AChE), thereby interfering with cholinergic neurotransmission in both humans
(Chambers 1992) and fish (Fulton and Key 2001). Because anticholin­esterase agents share a common
mode of toxic action, the National Academy of Sciences recommended a dose­additive approach to
assessing risks to human infants and children (NRC 1993). Dose addition (or, for waterborne exposures
to fish, concentration addition) assumes that the cumulative toxicity of the mixture can be estimated
from the sum of the individual toxic potencies of each individual component chemical. This is how the
U.S. EPA currently assesses the potential toxicity of mixtures of OP and CB insecticides in the context
of the FQPA.
The assumption of dose addition or concentration addition for mixtures of anti­cholinesterase
pesticides has also been extended to aquatic life (Junghans et al. 2006). In salmon, concentration­
additive inhibition of brain AChE activity by mixtures of OP and CB insecticides was recently
demonstrated in vitro (Scholz et al. 2006). However, the in vivo toxicity of anti cholinesterase mixtures
may deviate from concentration addition if the individual chemicals in a mixture interact via
toxicokinetic or toxicodynamic processes to produce either antagonistic or synergistic effects (Borgert
et al. 2004). Each of these possible outcomes (antagonism, addition, or synergism) has potentially
important implications for the current regulatory paradigm, wherein risks of pesticides to ESA­listed
salmonids are assessed based primarily on responses to single active ingredients. To define the extent
to which OP and CB insecticides in mixtures interact, we exposed juvenile coho salmon
(Oncorhynchus kisutch) to all possible binary combinations of the OP insecticides diazinon, malathion,
and chlorpyrifos and the CB insecticides carbaryl and carbofuran. We used the concentration–response
curves for AChE inhibition by individual chemicals to statistically define concentration addition (i.e.,
no interaction within a mixture).

Materials and Methods

Go to:

Fish Coho salmon eggs were obtained from the University of Washington hatchery (Seattle, WA) and
raised at the Northwest Fisheries Science Center’s hatchery (NWFSC, Seattle, WA). Juveniles were
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

4/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

maintained at the Washington State University Puyallup Research and Extension Center (Puyallup,
WA) for the duration of the study. Fish were held in recirculating tanks of dechlorinated municipal
water (hatchery water; temperature 11–13°C, pH 7.0–7.5, dissolved oxygen 90–100%, total hardness as
CaCO3 110–120 mg/L, and alkalinity 74 mg/L) on a 12­hr light–dark schedule. Fish were fed
commercial salmon pellets (Bio­Oregon, Warrenton, OR) daily. Fish used in experiments were 4–7
months of age with an average size ± SD of 4.9 ± 1.0 cm and 1.3 ± 0.9 g. Experiments followed
guidelines set by Washington State University’s Institutional Animal Care and Use Committee for the
humane treatment of fish to alleviate suffering during exposures and dissections.
Pesticide exposures Diazinon (CAS No. 333­41­5; 98% pure), malathion (CAS No. 121­75­5; 98%
pure), chlorpyrifos (CAS No. 2921­88­2; 98% pure), carbaryl (CAS No. 63­25­2; 99% pure), and
carbofuran (CAS No. 1563­66­2; 99% pure) were purchased from Chem Service (West Chester, PA).
Exposure concentrations used for both single­pesticide and mixture exposures are shown in Table 2.
Pesticide­containing stock solutions were prepared in methanol (or ethanol for chlorpyrifos) and added
in 100­μL aliquots to 25 L hatchery water in 30­L glass aquaria. Final carrier concentration in exposure
tanks was ≤ 0.0004% of the total volume. For each treatment, eight individual fish were exposed for 96
hr on a 24­hr static renewal schedule. Animals were not fed during the exposure interval. After
exposures, fish were terminally anesthetized by immersion in MS­222 (tricaine methanesulfonate, 5
g/L; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) until gill activity ceased. Brain tissues were removed, put
into plastic microcentrifuge tubes, and kept on ice until stored in a cryogenic (–80°C) freezer for
subsequent analyses of AChE enzymatic activity. In the three mixture exposures where mortality was
observed, dead fish were removed after 24 hr of exposure and processed for AChE analysis as
described above.

Table 2
Nominal concentrations (μg/L) used in both single­insecticide and mixture exposures.
Mixture exposures
Insecticide

Single exposures (concentration range) 1.0 EC50 0.5 EC50 0.2 EC50 0.05 EC50

Diazinon

1.0–500

145.0

72.5

29.0

7.3

Malathion

0.5–100

74.5

37.3

14.9

3.7

Chlorpyrifos

0.6–2.5

2.0

1.0

0.4

0.1

Carbaryl

1.0–150

145.8

72.9

29.2

7.3

Carbofuran

1.0–225

58.4

29.2

11.7

2.9

Median effective concentration (EC50) values were calculated using nonlinear regressions. For individual
chemicals, salmon were exposed to 4–7 concentrations within the indicated range.

Analytical chemistry Water samples were collected in 500­mL amber glass bottles from exposure
tanks immediately after pesticide addition. All analyses were conducted at Washington State
University’s Food and Environmental Quality Laboratory, following existing U.S. EPA methods.
Measured pesticide concentrations were generally between 80 and 120% of nominal concentrations (
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

5/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

Table 3). For single­chemical exposures, water samples collected at 96 hr indicated only a modest loss
(average 5–14%) in pesticide concentration over the course of a 24­hr renewal interval. Accordingly,
for subsequent exposures to mixtures, water samples were collected only at t = 0. Throughout this
article, pesticide exposures are reported in terms of nominal concentrations. Levels of chlorpyrifos in
single­pesticide exposures were not determined analytically, because a recent study (Sandahl et al.
2005) characterized the concentration–response relationship between nominal (and measured)
chlorpyrifos exposure and brain AChE inhibition in juvenile coho across a range of concentrations
identical to the nominal chlorpyrifos exposures used here (0–2.5 μg/L). Thus, in the present study, we
used AChE activity relative to published results (Sandahl et al. 2005) to confirm accurate dosing.

Table 3
Chemical analysis of insecticide concentrations from both single­insecticide and mixture
exposures.
Mixtures
Insecticide

Single

Diazinon

88 ± 18

63 ± 5

97 ± 11

106 ± 28

Malathion

89 ± 26

44 ± 27

91 ± 56

70 ± 27

NA

72 ± 7

79 ± 17

121 ± 15

Carbaryl

113 ± 21

118 ± 33

112 ± 9

108 ± 9

Carbofuran

115 ± 32

112 ± 12

130 ± 15

105 ± 6

Chlorpyrifos

1.0 EC50 0.4 EC50 0.1 EC50

Abbreviations: EC50, median effective concentration; NA, not analyzed. Values are average percent recovery
(relative to nominal concentrations) ± 1 SD.

AChE enzyme assays Determination of AChE activity followed the Ellman method (Ellman et al.
1960) as modified by Sandahl and Jenkins (2002). Briefly, whole brains were homogenized at 50
mg/mL in 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 8.0) with 0.1% Triton X­100. Homogenates were
centrifuged, and 15 μL of the supernatant was combined with 685 μL of 10 mM phosphate­buffered
saline, 50 μL of 6 mM DTNB [5,5′­dithio­bis(2­nitrobenzioc acid)], and 30 μL of 75 mM
acetylthiocholine iodide. All chemicals were from Sigma. Triplicate 200 μL samples were transferred
to a 96­well plate, and the change in absorbance (at 412 nm) was measured at 12­sec intervals for 5
min at 25°C on an Optimax plate reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). AChE activity was
quantified as milli optical density (mOD) per minute per gram of tissue and reported as a percentage of
the baseline enzyme activity for fish exposed to carrier alone.
Statistics and data analysis Statistical analyses were performed with either Prism 4.0 (GraphPad,
San Diego, CA) or KaleidaGraph (Synergy Software, Reading, PA) software. Tests included nonlinear
regression to fit curves of AChE activities, one­way analysis of variance (ANOVA) followed by
Dunnett’s post hoc test to establish differences between groups, and one­sample t­test with a
Bonferroni correction to test for differences between means and predicted values. To allow for a
Gaussian distribution of the error around the estimate of median effective concentration (EC50), the
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

6/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

nonlinear regression performed by Prism 4.0 uses log transformations of the concentrations and reports
an estimate of the log transformation of EC50.
Defining toxicologic inter actions between pesticides We used significant departures from additive
toxicity to define antagonistic and synergistic interactions between pesticides in mixtures (Hertzberg
and MacDonell 2002). Addition, in turn, describes an outcome of no interaction, where the predicted
toxicity of the mixture (as measured by brain AChE inhibition) is the sum of each chemical’s predicted
toxicity (toxic potential). We determined the individual toxic potential for all five pesticides empirically
from the concentration–response relationship for AChE inhibition in single­chemical trials. The
concentration of each pesticide was normalized to the respective EC50 concentration (the concentration
estimated to produce a 50% decrease in AChE activity relative to carrier controls) for that individual
chemical. The EC50­normalized data for all five pesticides were subsequently combined and fit with a
single regression. A hypothetical example of a resulting curve and its application to assessing mixture
interaction is shown in Figure 2A. For a mixture containing two pesticides at 0.1 and 0.3 EC50 units,
respectively, concentration addition occurs if the cumulative AChE inhibition is equivalent to 0.4 EC50
units. This outcome would fall on the curve or within the 95% prediction band for the regression.
Results falling significantly above the curve (less than expected inhibition) would be antagonistic, and
results falling significantly below the curve (more than expected inhibition) would be synergistic. In
this way, the curve fit to the data from single­chemical trials was used as a basis for detecting
interactions between OP and CB pesticides in mixtures.

Figure 2
Binary pesticide mixtures cause additive or synergistic AChE inhibition. (A) Hypothetical plot describing
the three possible toxicologic responses after exposure to a binary mixture of anticholinesterase pesticides.
The curve represents a single regression fit to the EC50­normalized data from single pesticide exposures.
(B) Plot of the concentration–response data from five single pesticide exposures after normalization to
their respective EC50 concentrations and collectively fitting with a nonlinear regression. This curve was
used to evaluate the toxicologic response of subsequent binary mixtures (C). Values are mean ± 1 SE (n =
8). (C) Plot of the brain AChE activities of fish exposed to the five pesticides in all possible binary
combinations. Based on a default assumption of concentration addition, the pairings were predicted to
yield AChE inhibitions of 10% (0.1 EC50), 29% (0.4 EC50), and 50% (1.0 EC50). Values are mean and SE
(n = 8); dashed lines indicate the 95% prediction band (where 95% of the data should fall based on the
regression).

Results

Go to:

Single pesticides Exposure to individual pesticides for 96 hr resulted in sublethal, concentration­
dependent decreases in brain AChE activity among juvenile coho salmon. No mortality was observed
at any of the single­chemical exposure concentrations. We found no significant differences in baseline
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

7/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

AChE activity between unexposed fish and those exposed to carrier alone (five one­way ANOVAs, p >
0.26). Therefore, AChE activity in pesticide­exposed fish is expressed as a percentage of carrier
controls. The mean AChE activity (± SD) for all controls (n = 109 animals) was 121.49 ± 13.18
mOD/min, or 14.7 ±1.6 μmoL/min/g. Concentration–response relationships were fit using a nonlinear
regression. The equation and resulting curve fit parameters are reported in Table 4. Despite the
potential for variability from toxico kinetic differences in absorption, distribution, metabolism, and
excretion, the slopes of the concentration–response curves were not significantly different (average =
0.96, F test, p = 0.1). The relative potencies of the five chemicals did vary, with chlorpyrifos >
carbofuran > malathion > diazinon > carbaryl (Table 2; EC50 values for AChE inhibition). The EC50­
normalized data for all five pesticides were then fit with a single nonlinear regression (r2 = 0.94; 
Figure 2B). As noted above, this curve was used as a basis to quantitatively determine whether specific
binary combinations of pesticides produce interactive (i.e., antagonistic or synergistic) toxicity.

Table 4
Parameters of the concentration–response curves after in vivo exposure to individual
insecticides.
Insecticide

a
Log EC50 (± SE)

2
R

Slope ± SE

Diazinon

2.2 ± 0.1

0.95 −0.79 ± 0.15

Malathion

1.90 ± 0.05

0.97 −1.32 ± 0.20

Chlorpyrifos

0.30 ± 0.02

0.98 −1.50 ± 0.17

2.2 ± 0.1

0.95 −0.81 ± 0.16

1.80 ± 0.09

0.95 −0.82 ± 0.15

Carbaryl
Carbofuran

a

SE of the nonlinear regression; EC50 values are presented as μg/L.

Pesticide mixtures Based on a default assumption of dose addition, the five pesticides were combined
in all possible pairings to yield predicted AChE inhibitions of 10%, 29%, and 50% in the brains of
exposed coho salmon. As determined by the regression in Figure 2B, these levels of enzyme inhibition
would result from exposure to 0.1, 0.4, and 1.0 EC50 units, respectively. All binary pesticide
combinations produced toxicity that was either additive or synergistic, with the frequency of synergism
increasing at higher exposure concentrations (Figure 2C). In all cases, the joint toxicity from the paired
exposures resulted in AChE activities that were significantly lower than carrier controls (one­way
ANOVA; p< 0.05).
The degree of AChE inhibition in response to specific combinations of OP and CB pesticides is shown
in Figure 3. For each of the three EC50 units (0.1, 0.4, and 1.0), the measured values for AChE activity
are plotted as bars that originate from a horizontal line indicating a (noninteractive) dose­additive
response. All combinations of insecticides at each of the three sets of concentrations deflected
downward, indicating a tendency toward synergism. Most pesticide pairs yielded rates of enzyme
activity significantly lower than would be expected based on concentration addition (t­test with
Bonferroni correction, p < 0.005). The number of statistically synergistic combinations (indicated by
asterisks in Figure 3; 20 of 30 pairings overall) increased with increasing exposure concentrations.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

8/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

Additionally, pairings of two OPs produced a greater degree of synergism than mixtures containing one
or two CB insecticides. This was particularly true for mixtures containing malathion together with
either diazinon or chlorpyrifos. At the highest exposure concentration (1.0 EC50), the toxicity of every
insecticide mixture was synergistic.

Open in a separate window
Figure 3
Degree of AChE inhibition in the response to binary combinations of OP and CB pesticides. (A ) 10% (0.1
EC50). (B) 29% (0.4 EC50). (C) 50% (1.0 EC50). OP–OP pairings tended to be more synergistic than other
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

9/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

pairings, producing 100% mortality (M) at concentrations that were sublethal in single pesticide
exposures. The number of combinations that were statistically synergistic (t­test with Bonferroni
correction, denoted by asterisks) increased with increasing exposure concentrations. Bars are means (n =
8), and error bars indicate the 95% CIs of the mean.

Coho exposed to combinations of diazinon and malathion (1.0 and 0.4 EC50), as well as chlorpyrifos
and malathion (1.0 EC50), had the lowest measured AChE activities. Many fish species die after high
rates of acute brain AChE inhibition (> 70–90%; Fulton and Key 2001). As expected from these
previous studies, 100% mortality was observed within the first 24 hr among coho exposed to the above
pesticide combinations. Fish exposed to these OP mixtures also showed qualitative signs of anti­
cholinesterase toxicity, including loss of equilibrium, rapid gilling, altered startle response, and
increased mucus production. Although we observed no mortality among coho exposed to the lowest
combinations of diazinon and malathion (0.1 EC50), all of the fish in this treatment group displayed
overt symptoms of sublethal cholinergic poisoning by the end of the 96­hr exposure interval.
Therefore, biochemical indicators of synergism (greater than additive AChE inhibition) were consistent
with classical signs of anticholinesterase intoxication and death for salmon exposed to mixtures of OP
pesticides.

Discussion

Go to:

We have shown that in vivo exposures to binary mixtures of OP and CB pesticides produced additive or
synergistic AChE inhibition in the brains of juvenile coho salmon. The statistical departure from dose
addition occurred for several chemical combinations at each of the three relative exposure
concentrations, with a trend toward a higher incidence of synergism at the higher exposures. Where the
degree of synergism was severe (e.g., for pairings of diazi­non and malathion), enhanced AChE
inhibition (i.e., > 90%) corresponded to overt signs of anticholinesterase intoxication and death. This
result is consistent with previous (single­chemical) OP and CB pesticide toxicity studies in other fish
species (reviewed by Fulton and Key 2001). At present, diazinon, chlorpyrifos, malathion, carbaryl,
and carbofuran are some of the most extensively used insecticides in California and the Pacific
Northwest (California Department of Pesticide Regulation 2008). The frequency with which these
chemicals are detected in some salmon habitats (Table 1) and their combinatorial toxicity to juvenile
salmon when they occur as mixtures suggest they may be limiting the recovery of several threatened
and endangered populations.
The OP (oxon metabolites) and CB insecticides examined in this study do not interact in vitro, where
their combinatorial inhibition of salmon AChE can be explained by simple concentration addition
(Scholz et al. 2006). The departure from concentration addition for some pesticide pairings in vivo is
consistent with OP and CB insecticides acting on other biochemical targets. Although more work is
needed to identify these targets, car­boxylesterases (CaEs) are candidate enzymes that may underlie the
chemical interactions observed in this study. CaEs play an important role in the detoxification of many
pesticides, including the OP and CB insecticides, via hydrolysis (Jokanovic 2001; Wheelock et al.
2005a). CaEs may also functionally protect AChE from insecticide toxicity by direct binding and
sequestration, thereby preventing or delaying interaction between the insecticide and AChE (Jokanovic
2001; Maxwell 1992a). Mammalian studies spanning several decades have shown that
anticholinesterase toxicity increases when CaE enzyme activity is inhibited (Casida et al. 1963;
Jokanovic 2001; Maxwell 1992b; Su et al. 1971). Although few studies are documented in fish,
exposures to OP and CB pesticides have been found to reduce liver CaE activity in salmonids (Ferrari
et al. 2007; Wheelock et al. 2005b), with the OP chlorpyrifos acting as a more potent inhibitor of CaE
activity than AChE activity (Wheelock et al. 2005b). In another aquatic species (Daphnia magna),
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

10/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

pharmacologic inhibition of CaE significantly enhanced the toxicity of chlorpyrifos, malathion, and
carbofuran (Barata et al. 2004). Thus, although other biochemical targets may be involved in OP and
CB synergism (Casida and Quistad 2004), future mechanistic studies should give particular
consideration to the role of CaEs in the pesticide interactions observed in this study.
To identify interactions between pesticides in mixtures, it was first necessary to normalize each
concentration–response curve using the calculated EC50 concentration for that individual chemical. For
all five insecticides, the concentrations that produce 50% brain AChE inhibition in salmon (Table 2)
are approximately 10­ to 1,000­fold higher than the levels typically detected in surface water
monitoring investigations (Hoffman et al. 2000). However, we show here that many insecticide
combinations produce additive toxicity at low, environmentally relevant concentrations (0.1 EC50; 
Figure 3A). Moreover, certain combinations showed a clear pattern of synergism even at these
relatively low levels. For example, diazinon and chlorpyrifos were synergistic when combined at 7.3
μg/L and 0.1 μg/L, respectively. Surface water monitoring in the San Joaquin basin in California
(Dubrovsky et al. 1998) reported diazinon concentrations as high as 6.0 μg/L and chlorpyrifos levels up
to 0.5 μg/L. The pairing of diazinon (7.3 μg/L) with malathion (3.7 μg/L) produced severe (> 90%)
AChE inhibition as well as classical signs of anticholinesterase poisoning. Thus, for some chemical
combinations, synergism is likely to occur at exposure concentrations below the lowest levels used in
the present study. Although more work is needed to determine the lower bounds for pesticide
interactions, this study indicates that synergism is likely to occur at concentrations that have been
directly measured in habitats supporting threatened and endangered salmonids.
In quantitative terms, we have shown that an in vivo screen for interactions between anticholinesterase
insecticides is tractable in juvenile salmon. Although we examined only five pesticides, it would be
straightforward to establish concentration–response relationships for AChE inhibition for the remaining
OP and CB insecticides in current use. Given default assumptions of common mode of action and
concentration addition (Lambert and Lipscomb 2007), the relative potency of each insecticide could
then be used to estimate the joint toxicity of chemicals in a mixture using a conventional toxic unit
approach (Junghans et al. 2006). Widely used insecticides and those with a relatively high toxic
potency (e.g., the OP azinphos­methyl) could also be screened for interactions with other insecticides at
low, environmentally realistic exposure concentrations. Where synergism occurs, additional safety
factors could then be assigned to protect the health of threatened and endangered salmon. With the
exception of safety factors for synergism, this process is similar to how the FQPA mandates evaluating
the human health risks of OP and CB mixtures (FQPA 1996).
Although habitat degradation is generally accepted to be a major causal factor in salmon declines (NRC
1996), the specific contributions of current­use pesticides to the decline of salmon populations are not
well understood. One key challenge to understanding this relationship is linking pesticide effects on
individual fish to the intrinsic productivity of populations. Recent data by Sandahl et al. (2005) began
to address this challenge by showing that exposures to low, environmentally realistic concentrations of
chlorpyrifos produced reductions in AChE activity that were closely correlated to reductions in
swimming speed and feeding rates. Reductions in feeding are likely to lead to reductions in the size of
exposed salmon at the time of their seaward migration, an end point that has been shown to be an
important determinant of individual salmon survival (Higgs et al. 1995; Zabel and Achord 2004). By
reducing survival rates, sublethal inhibition of AChE in juvenile salmon could potentially reduce the
intrinsic productivity of salmon populations. Because mixtures of OP and CB insecticides produce
dose­additive or synergistic AChE inhibition, they could magnify these population­scale effects.
The link to populations is important because most of the ongoing recovery planning for ESA­listed
salmon is focused at this biological scale (Ruckelshaus et al. 2002). Although many salmon habitats are
affected by agrochemicals and urban runoff, restoration priorities are usually developed without the
specific inclusion of toxics in quantitative analyses of limiting factors (Bartz et al. 2006; Burnett et al.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

11/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

2007; Hoekstra et al. 2007; Scheuerell et al. 2006). In the larger context of salmon conservation, a
future priority will be to establish a quantitative connection between the mixture toxicity observed in
this study and higher biological scales via effects on growth and survival. This connection will help to
bridge the disciplines of ecotoxicology and conservation biology (Hansen and Johnson 1999) in their
common goal of guiding the recovery of threatened and endangered species.

Conclusion

Go to:

These results have important implications for ecological risk assessments, particularly those that focus
on the toxicity of individual chemicals as the basis for estimating impacts to imperiled aquatic species.
Although the importance of multiple stressors is widely recognized in aquatic ecotoxicology (Eggen et
al. 2004), pesticide mixtures continue to pose major challenges for natural resource agencies (Gilliom
2007; Lydy et al. 2004). These challenges include the data gaps that exist for many individual
chemicals, experimental design difficulties (e.g., near­insurmountable factorial complexity for large
numbers of chemicals), poorly understood pathways for chemical interaction, potential differences in
response among species, and the need for more sophisticated statistical tools for analyzing complex
data. Salmon exposed to mixtures containing some of the most intensively used insecticides in the
western United States showed either concentration­additive or synergistic neurotoxicity as well as
unpredicted mortality. This implies that single­chemical assessments will systematically underestimate
actual risks to ESA­listed species in salmon­supporting watersheds where mixtures of OP and CB
pesticides occur.

Footnotes

Go to:

We thank G. Jack, E. Culbert, J. LePage, B. French, J. Labenia, T. Linbo, and M. Boroja for their valuable
assistance. We thank S. Hecht, T. Hawkes, and E. Gallagher for their critical review of this manuscript.
The National Oceanic and Atmospheric Administration Office of Protected Resources and Coastal Storms Program
provided financial support for this research.

References

Go to:

Barata C, Solayan A, Porte C. Role of B­esterases in assessing toxicity of organophosphorus
(chlorpyrifos, malathion) and carbamate (carbofuran) pesticides to Daphnia magna. Aquat Toxicol.
2004;66:125–139. [PubMed]
Bartz KK, Lagueux KM, Scheuerell MD, Beechie T, Haas AD, Ruckelshaus MH. Translating
restoration scenarios into habitat conditions: an initial step in evaluating recovery strategies for
Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) Can J Fish Aquat Sci. 2006;63:1578–1595.
Borgert C, Quill T, McCarty L, Mason A. Can mode of action predict mixture toxicity for risk
assessment? Toxicol Appl Pharmacol. 2004;201:85–96. [PubMed]
Burnett KM, Reeves GH, Miller DJ, Clarke S, Vance­Borland K, Christiansen K. Distribution of
salmon­habitat potential relative to landscape characteristics and implications for conservation.
Ecol Appl. 2007;17(1):66–80. [PubMed]
California Department of Pesticide Regulation. Registered Pesticide Use. 2008. [[accessed 10
November 2008]]. Available: http://cdpr.ca.gov/docs/pur/pur­main.htm.
Carpenter KD, Sobieszczyk S, Arnsberg AJ, Rinella FA. Pesticide Occurrence and Distribution in the
Lower Clackamus River Basin, Oregon, 2000–2005. Reston, VA: U.S. Geological Survey; 2008.
Casida JE, Baron RL, Eto M, Engel JL. Potentiation and neurotoxicity induced by certain
organophosphates. Biochem Pharmacol. 1963;12:73–83. [PubMed]
Casida J, Quistad G. Organophosphate toxicology: safety aspects of nonacetylcholinesterase secondary
targets. Chem Res Toxicol. 2004;17(8):983–998. [PubMed]
Chambers HW. Organophosphorus compounds: an overview. In: Chambers JE, Levi PE, editors.
Organophosphates: Chemistry, Fate and Effects. San Diego, CA: Academic Press; 1992. pp. 3–17.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

12/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

Clean Water Act of 1972. 1972. Public Law 92–500.
Domagalski JL, Knifong DL, Dileanis PD, Brown LR, May JT, Connor V, et al. Water Quality in the
Sacramento River Basin, California, 1994–98. Reston, VA: U.S. Geological Survey; 2000.
Dubrovsky NM, Kratzer CR, Brown LR, Gronberg JM, Burow KR. Water Quality in the San Joaquin­
Tulare Basins, California, 1992–95. Reston, VA: U.S. Geological Survey; 1998.
Ebbert JC, Embry SS, Black RW, Tesoriero AJ, Haggland AL. Water Quality in the Puget Sound Basin,
Washington and British Columbia, 1996–98. Reston, VA: U.S. Geological Survey; 2000.
Eggen RIL, Behra R, Burkhardt­Holm P, Escher BI, Schweigert N. Challenges in ecotoxicology.
Environ Sci Technol. 2004;38(3):59A–64A. [PubMed]
Ellman G, Courtney D, Andres V, Jr, Featherstone R. A new and rapid colorimetric determination of
acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol. 1960;7:88–95. [PubMed]
ESA (Endangered Species Act of 1973). 1973. Public Law 93–205.
Federal Food, Drug, and Cosmetic Act of 1938. 1938. Public Law 717.
Federal Insecticide Fungicide and Rodenticide Act of 1972. 1972. Public Law 92–516.
Ferrari A, Venturino A, Pechen de D’Angelo A. Effects of carbaryl and azinphos methyl on juvenile
rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) detoxifying enzymes. Pestic Biochem Physiol. 2007;88:134–
142.
FQPA (Food Quality Protection Act of 1996). 1996. Public Law 104–170.
Fuhrer GJ, Morace JL, Johnson HM, Rinella JF, Ebbert JC, Embry SS, et al. Water Quality in the
Yakima River Basin, Washington, 1999–2000. Reston, VA: U.S. Geological Survey; 2004.
Fulton MH, Key PB. Acetylcholinesterase inhibition in estuarine fish and invertebrates as an indicator
of organo­phosphorus insecticide exposure and effects. Environ Toxicol Chem. 2001;20(1):37–45.
[PubMed]
Gilliom RJ. Pesticides in U.S. streams and groundwater. Environ Sci Technol. 2007;41(10):3407–3413.
[PubMed]
Hansen LJ, Johnson ML. Conservation and toxicology: integrating the disciplines. Conservation Biol.
1999;13(5):1225–1227.
Hertzberg R, MacDonell M. Synergy and other ineffective mixture risk definitions. Sci Total Environ.
2002;288:31–42. [PubMed]
Higgs DA, MacDonald JS, Levings CD, Dosanjih BS. Nutrition and feeding habits in relation to life
history stage. In: Groot C, Margolis L, Clarke WC, editors. Physiological Ecology of Pacific
Salmon. Vancouver, BC: UBC Press; 1995. pp. 161–315.
Hoekstra JM, Bartz KK, Ruckelshaus MH, Moslemi JM, Harms TK. Quantitative threat analysis for
management of an imperiled species: Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) Ecol Appl.
2007;17(7):2061–2073. [PubMed]
Hoffman RS, Capel PD, Larson SJ. Comparison of pesticides in eight U.S. urban streams. Environ
Toxicol Chem. 2000;19(9):2249–2258.
Jokanovic M. Biotransformation of organophosphorus compounds. Toxicol. 2001;166:139–160.
[PubMed]
Junghans M, Backhaus T, Faust M, Scholze M, Grimme LH. Application and validation of approaches
for the predictive hazard assessment of realistic pesticide mixtures. Aquat Toxicol. 2006;76:93–
110. [PubMed]
Kiely T, Donaldson D, Grube A. Pesticides Industry Sales and Usage: 2000 and 2001 Market
Estimates. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency; 2004. [[accessed 27 January
2009]]. EPA 733­R­04­001. Available: http://www.epa.gov/opp­
bead1/pestsales/01pestsales/market_estimates2001.pdf.
Lambert JC, Lipscomb JC. Mode of action as a determining factor in additivity models for chemical
mixture risk assessment. Regulat Toxicol Pharmacol. 2007;49:183–194. [PubMed]
Lydy M, Belden J, Wheelock C, Hammock B, Denton D. Challenges in regulating pesticide mixtures.
[[accessed 27 January 2009]];Ecol Soc. 2004 9(6):1. Available:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

13/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

http://www.ecologyandsociety.org/vol9/iss6/art1/
Maxwell DM. Detoxication of organophosphorus compounds by carboxylesterase. In: Chambers JE,
Levi PE, editors. Organophosphates: Chemistry, Fate, and Effects. San Diego: Academic Press Inc;
1992a. pp. 183–199.
Maxwell DM. The specificity of carboxylesterase protection against the toxicity of organophosphorus
compounds. Toxicol Appl Pharmacol. 1992b;114:306–312. [PubMed]
Monosson E. Chemical mixtures: considering the evolution of toxicology and chemical assessment.
Environ Health Perspect. 2005;113:383–390. [PMC free article] [PubMed]
Nehlsen W, Williams JE, Lichatowich JA. Pacific salmon at the crossroads: stocks at risk from
California, Oregon, Idaho, and Washington. Fisheries. 1991;16(2):4–21.
NOAA Fisheries (National Oceanic and Atmospheric Administration, National Marine Fisheries
Service) ESA Salmon Listings. 2008. [[accessed 5 November 2008]]. Available:
http://www.nwr.noaa.gov/ESA­Salmon­Listings/Index.cfm.
NRC (National Research Council) Pesticides in the Diets of Infants and Children. Washington, DC:
National Academy Press; 1993.
NRC (National Research Council) Upstream: Salmon and Society in the Pacific Northwest.
Washington, DC: National Academy Press; 1996.
Ruckelshaus MH, Levin P, Johnson JB, Kareiva PM. Pacific salmon wars: what science brings to the
challenge of recovering species. Annu Rev Ecol Syst. 2002;33:665–706.
Sandahl JF, Baldwin DH, Jenkins JJ, Scholz NL. Comparative thresholds for acetylcholinesterase
inhibition and behavioral impairment in coho salmon exposed to chlorpyrifos. Environ Toxicol
Chem. 2005;24(1):136–145. [PubMed]
Sandahl JF, Jenkins JJ. Pacific steelhead (Oncorhynchus mykiss) exposed to chlorpyrifos: benchmark
concentration estimates for acetylcholinesterase inhibition. Environ Toxicol Chem.
2002;21(11):2452–2458. [PubMed]
Scheuerell MD, Hilborn R, Ruckelshaus MH, Bartz KK, Lagueux KM, Haas AD, et al. The Shiraz
model: a tool for incorporating anthropogenic effects and fish­habitat relationships in conservation
planning. Can J Fish Aquat Sci. 2006;63:1596–1607.
Scholz NL, Truelove NK, Labenia JS, Baldwin DH, Collier TK. Dose­additive inhibition of chinook
salmon acetyl­cholinesterase activity by mixtures of organophosphate and carbamate insecticides.
Environ Toxicol Chem. 2006;25(5):1200–1207. [PubMed]
Su MQ, Kinoshita FK, Frawley JP, Dubois KP. Comparative inhibition of aliesterases and
cholinesterase in rats fed eighteen organophosphorus insecticides. Toxicol Appl Pharmacol.
1971;20:241–249. [PubMed]
U.S. EPA. Guidance on Cumulative Risk Assessment of Pesticide Chemicals That Have a Common
Mechanism of Toxicity . Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency; 2002.
[[accessed 27 January 2009]]. Available:
http://epa.gov/oscpmont/sap/meetings/2003/december11/cumulativeguidance2002.pdf.
USGS (U.S. Geological Survey) National Water­Quality Assessment (NAWQA) Program. 2008.
[[accessed 5 November 2008]]. Available: http://water.usgs.gov/nawqa/pnsp/
Washington State Department of Ecology. Surface Water Monitoring Program for Pesticides in
Salmonid­Bearing Streams, 2007 Data Summary. 2008. [[accessed 5 November 2008]]. Available:
http://www.ecy.wa.gov/biblio/0803009.html.
Wentz DA, Bonn BA, Carpenter KD, Hinkle SR, Janet ML, Rinella JF, et al. Water Quality in the
Willamette Basin, Oregon, 1991–95. Reston, VA: U.S. Geological Survey; 1998.
Wheelock CE, Shan G, Ottea J. Overview of carboxyl­esterases and their role in the metabolism of
insecticides. J Pest Sci. 2005a;30(2):75–83.
Wheelock CE, Werner I, Huang H, Jones PD, Brammell BF, Elskus AA, et al. Individual variability in
esterase activity and CYP1A levels in Chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha) exposed to
esfenvalerate and chlorpyrifos. Aquat Toxicol. 2005b;74:172–192. [PMC free article] [PubMed]
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

14/15

 6/5/2018

The Synergistic Toxicity of Pesticide Mixtures: Implications for Risk Assessment and the Conservation of Endangered Pacific Salmon

Williamson AK, Munn MD, Ryker SJ, Wagner RJ, Ebbert JC, Vanderpool AM. Water Quality in the
Central Columbia Plateau, Washington and Idaho, 1992–95. Reston, VA: U.S. Geological Survey;
1998.
Zabel RW, Achord S. Relating size of juveniles to survival within and among populations of chinook
salmon. Ecology. 2004;85:795–806.
Articles from Environmental Health Perspectives are provided here courtesy of National Institute of
Environmental Health Science

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2661902/

15/15